纳豆激酶溶血栓作用的研究

为了让大家更加了解纳豆激酶，小宇通过相关学术杂志，找到一些关于纳豆及纳豆激酶的理论知识，仅供大家参考！

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心脑血管疾病患者的福音——纳豆激酶！

本文选择《山东农业大学学报》（自然科学版）

2005,36（4）:625~631

摘要：本研究通过纳豆激酶纤维蛋白溶解活性实验、纳豆激酶体内血栓溶解实验对纳豆激酶的溶栓作用做了较全面的研究。对纤维蛋白溶解活性研究结果显示：高、中、低剂量的纳豆激酶均能显著地降低血浆优球蛋白的溶解时间、显著地降低血浆纤维蛋白原的含量、显著地增加纤维蛋白裂解产物的含量，表明纳豆激酶具有较强的纤维蛋白溶解性，且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比，前者的纤溶性大于后者；体内血栓溶解的实验结果显示：纳豆激酶可明显地延长血栓形成时间、显著减少股动脉的长度及湿重并明显提高血栓的再通率、显著减少肺内血栓的形成，表明纳豆激酶具有较强的体内溶栓作用，且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比，前者的溶栓作用高于后者。显示了纳豆激酶具有强大的溶栓作用， 且起效快、药效长，有望成为一代溶栓药物。

关键词：纳豆激酶；纤维蛋白；溶解活性；溶栓作用

栓塞性疾病严重地危害着人类的生命健康, 尤其是心脑血管栓塞性疾病是危害中、老年人健康最严重而又常见的疾病之一。血栓症日渐成为死亡率占首位的病症[ 1] 。溶解血栓是治疗这一类疾病的重要手段。因此, 对溶栓药物的研究已被广为重视。链激酶(St reptokinase ;SK)和尿激酶(Urokinase ;UK)作为第一代溶栓药物在临床上广为应用, 但它们均对纤维蛋白无特异性选择作用, 容易引起全身性纤溶激活并伴有出血倾向、半衰期短等缺点。第二代溶栓药物包括组织型纤溶酶原激活剂(Ti ssue Plasminog en Activato r ;t - PA )、茴香酰纤溶酶原———链激酶复合物(A cety iated Plasminogen St reptokinase Activator Complex ;APSAC)、重组单链尿激酶(Recombinant Sing le Urokinase ;rSCU - PA)和葡激酶(Staphylo kinase;sk)等, 它们的纤溶作用优于第一代溶栓药, 但它们依然具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。鉴于此, 开发新型溶栓药物已成为重要的研究课题之一。目前, 纳豆激酶(Nat to kinase ;NK)作为高效安全并可直接溶解纤维蛋白的纤溶酶, 正在成为当今溶栓药研究的焦点。

纳豆激酶是由日本学者S umi 等[ 2] 于1987 年首次发现的, 它是纳豆(Nat to)发酵而产生的一种具有强烈纤溶作用的酶, 该酶能显著地溶解体内外血栓, 明显缩短优球蛋白的溶解时间, 从而成为一种很有潜力的新型溶栓药物。纳豆激酶在日本已得到广泛深入的研究, 在我国还刚刚起步, 它将成为医疗和发酵工业上新的热点。

本研究通过纳豆激酶纤维蛋白溶解活性实验和纳豆激酶体内血栓溶解实验;对纳豆激酶的溶栓作用作了较全面的研究。

1 　材料和方法

1. 1 　纳豆激酶对纤维蛋白的溶解活性实验

1. 1. 1 　本实验包括:实验1 :血浆优球蛋白溶解时间(Euglobulin lysi s Time ;ELT)的测定[ 3] ;实验2 :血浆纤维蛋白原含量的测定[ 3] ;实验3 :纤维蛋白裂解产物(FDP)的测定[ 3] 分别按参考文献进行测定。

1. 1. 2 　实验设计:日本大耳白30 只, 随机分为5 组, 分别为:空白对照组(生理盐水,NS)、低剂量组(NK :1000U /kg)、中剂量组(NK :2000U /kg)、高剂量组(NK :4000U /kg)和阳性对照组(UK :2000U /kg)。各血样均在给药30min 时采集。

1. 1. 3 　主要试剂:硫酸鱼精蛋白(25g , P - 4380 , SIGMA 公司);凝血酶(牛血) (每支相当于210 个BP 单位, 605 - 0123 );尿激酶(10 万单位, 001202 );尿激酶(标准品)(每支含830 个单位, 604 - 200020 );纳豆激酶。

1. 2 　纳豆激酶的体内血栓溶解实验

1. 2. 1 　本实验包括:实验1 :NK 对颈动脉血栓形成的影响[ 4 , 5] ;实验2 :NK 对兔股动脉血栓的再通作用[ 6 , 7] ;实验3 :NK 对实验性肺栓塞的溶栓效应[ 8] , 分别参照相关文献进行。

1. 2. 2 　实验设计:大鼠(Wistar)24 只, 随机分为3 组, 分别为:空白对照组(生理盐水,NS)、试验组(NK :4000U /kg)和阳性对照组(UK :4000U /kg);日本大耳白兔18 只, 随机分为3 组, 分别为:空白对照组(生理盐水,NS)、试验组(NK :10 ×104 )和阳性对照组(UK :1. 0 ×104 );日本大耳白兔18 只, 随机分为3 组,分别为:空白对照组(生理盐水,NS)、试验组(NK :2000U /kg)和阳性对照组(UK :2000U /kg)。

1. 2. 3 　主要试剂:尿激酶(标准品)(每支含830 个单位, 604 - 200020 );纳豆激酶。

1. 3 　数据处理

量反应资料进行T 检验；

质反应资料进行x2 检验及简化直接概率法；

实验数据用SAS 软件(10. 0 版)进行统计分析；

2 　结果与分析

2. 1 　纳豆激酶纤维蛋白的溶解活性实验

2. 1. 1 　NK 对血浆优球蛋白溶解时间(ELT)的影响　本实验采用优球蛋白溶解法, 在给药30min 时采集血样, 制备血凝块, 记录从加入凝血酶到凝块完全溶解的时间, 即优球蛋白溶解时间ELT(单位:S)。将溶解时间换算成纤维蛋白溶解活性单位, 实验结果见表1 。其换算公式如下:

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***表示与空白对照组相比， P <0. 01 ， 表明它们之间的差别具有非常显著的意义；

△△△表示与阳性对照组相比，P <0. 01 ， 表明它们之间的差别具有非常显著的意义。

以上结果表明：阳性对照组和给药组， 均可使血浆优球蛋白溶解时间显著缩短，且各给药组间比较，未见明显量效相关性。低剂量组和高剂量组分别与阳性对照组相比， P >0. 05 ， 故它们之间的差别无显著意义。

2. 1. 2 　NK 对血浆纤维蛋白原含量(FIB)的影响　

采用血浆凝固法。将采集的血浆制备纤维蛋白凝块，记录形成可见的纤维蛋白凝块的最高稀释度。正常应>1 :160 。实验结果见表2 。

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以上结果显示：阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的血浆均呈阳性；空白对照组的血浆呈阴性。表明阳性对照组和各试验组均可增加血浆中纤维蛋白原的含量。

2. 1. 3 　纤维蛋白裂解产物(FDP)的测定结果　

采用鱼精蛋白副凝(3P)试验法。将制备的血浆中加入副凝剂硫酸鱼精蛋白，用放大镜观察反映结果。阴性:血浆清晰， 或呈均一的乳白色；阳性：细颗粒深沉，直至纤维蛋白丝、纤维蛋白网或胶冻形成；正常血浆为阴性。实验结果见表3 。

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以上结果显示：阳性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组的血浆均呈阳性；空白对照组的血浆呈阴性。阳性对照组和各试验组均可使FDP 的含量增加。

2. 2 　纳豆激酶的体内血栓溶解实验

2. 2. 1 　NK 对颈动脉血栓形成的影响

采用电刺激血栓形成法。给药后制备颈动脉血栓模型, 观察从血栓形成到动脉血流完全阻断所需要的时间, 即阻塞时间。结果见表4 。

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以上结果显示:阳性对照组和试验组均能显著地延长OT 时间。

2. 2. 2 　NK 对兔股动脉栓塞的再通作用　

采用股动脉富含红细胞血栓模型。手术制备富含红细胞血栓,股动脉血流量值基本为零时, 表示造模成功。后静脉给药, 30min 时, 记录股动脉血流量, 并观察动脉再通率、动脉再通时间、残留血栓长度及湿重、给药前后不同时间段股动脉血流量。动脉再通率以给药40min后血流量恢复至基础值50 %, 为动脉血管再通标志;动脉再通平均时间即为血流量恢复至基础值50 %的时间。实验结果见表5 。

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以上结果显示:再通时间按120min 计算, 空白对照组无一侧股动脉再通。给予NK 和UK 后，约40min 后, 各试验组动物股动脉平均血流量恢复50 %以上, 再通成功。

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以上结果表明:给药前各组动物和血流量基础值基本一致, 血栓形成后, 股动脉流量基本为零, 空白对照组造型120min 内, 血流量未见变化。给予NK 或UK 后, 随着时间的增加, 动脉血流量渐渐恢复, 接近基础值的50 %, 各组动物给药前后的血流量有很大的变化。空白对照组造模及静脉输注对照组溶液后,动脉股动脉平均血流量基本为零, 未见显著改变, 给予NK 后第45min 起, 股动脉的平均血流量即有明显增加, 60min 时, 血流量恢复50 %;给予UK45min 左右, 平均血流量才较明显的增加, 约120min , 动物股动脉平均血流量才逐渐恢复接近基础值50 %的水平。试验组和阳性对照组相比, 试验组起效明显快于阳性对照组。

2. 2. 3 　NK 对实验性肺栓塞的溶栓效应　

采用Now ak 手术法。对动、静脉插管制备肺栓塞, 在第一栓子释放10min 后给药, 并释放第二栓子, 在给药10h , 取出心、肺内血栓, 观察栓重并对血栓样本进行扫苗电镜观察、固定肺脏制备石蜡切片进行病理组织学观察。

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以上结果显示:空白对照组动物股动脉残存血栓基本占满动脉管腔, 给予不同药液后, 血栓体积明显缩小, 多呈附壁状, 形态断裂不完整。给予NK 和UK 后, 动物股动脉血栓的长度和湿度显著减少。

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图1 、图2 　空白对照组　肺小动脉、小静内可见血栓形成的血栓及透明血栓

图3 、图4 　阳性对照组　小静脉内形成透明血栓

图5 、图6 　试验组　小动脉内、小静脉内及毛细血管内未见透明血栓及淤血

病理切片观察结果:

空白对照组在肺小动脉内形成大的血栓, 有的血栓附着于血管壁上, 头、体、尾明显(见图1), 头部主要由白细胞和血小板组成, 染色呈蓝色;体部主要由白细胞、血小板和红细胞组成, 呈红、蓝相间的结构;尾部主要由密集的红细胞组成, 呈红色。有的血栓脱落。形成结构完整的栓子, 可在肺其它小动脉内见到这种栓子。在小静脉及毛细血管内形成透明血栓(见图2);阳性对照组形成小的血栓, 只在小静脉及毛细血管中形成透明血栓(见图3 、4);试验组在肺小动脉、小静脉及毛细血管内均不形成血栓(见图5 、6)。

扫描电镜观察结果:

与对照组相比, NK 组血栓表面及纵切面的纤维蛋白丝明显变细、变短, 且结构疏松(见图9 、12);UK组血栓表面及纵切面的纤维蛋白丝相对空白对照组则比较细、短。(见图8 、11);而空白对照组血栓表面及纵切面的纤维蛋白丝则相对较细、短且结构紧密(见图7 、10)。有人认为“细”纤维蛋白丝的形成是由纤维蛋白原释放肽A 后, 端对端聚集所致;再释放肽B , 则观察到“粗” 纤维, 这是边对边的聚集, 两者具有几何学构型的不同[ 9] 。本实验中对照组血栓结构中纤维蛋白丝明显增粗, 可能是因凝血酶水解纤维蛋白原肽A 和肽B , 形成边对边聚集之故;而NK 组的纤维蛋白则可由于NK 对α链的直接降解[ 10 , 11] , 影响了上述聚合方式, 而以端对端聚集, 形成电镜下所见的这种细而疏松的纤维蛋白网结构。

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3 　讨论与结论

3. 1 　纳豆激酶纤维蛋白溶解活性的研究

3. 1. 1 　NK 对血浆优球蛋白的溶解时间(ELT)的影响　

血浆优球蛋白组分中含有纤维蛋白原、血浆素原及激活剂, 而不含或很少含抗血浆素, 将此沉淀溶于缓冲液后, 再加入氯化钙或凝血酶, 出现凝块。分析凝块完全溶解的时间(即优球蛋白的溶解时间)即可推知受试血浆中纤维蛋白原、血浆素原及激活纤溶系统有关, 可使纤溶酶原激活生成纤溶酶。试验组动物其血浆优球蛋白的溶解时间显著变短NK 可使ELT 显著缩短, 表明其溶栓作用与激活纤溶系统有关。且相同剂量下, NK 的纤维蛋白溶解活性明显高于UK 。

3. 1. 2 　NK 对血浆纤维蛋白原含量(FIB)的影响　

用系列稀释的血浆测定凝血酶的时间, 出现纤维蛋白凝块的稀释度与血浆中纤维蛋白原的含量成正比。稀释度越小, 说明血浆中纤维蛋白原的含量越小。试验组形成纤维蛋白凝块的最高稀释度最大, 即NK 可使血浆中纤维蛋白原含量显著减少, 且无明显的量效关系。表明NK 可直接水解纤维蛋白原或激活纤溶酶原。且相同剂量下, NK 的纤维蛋白溶解活性明显高于UK 。

3. 1. 3 　NK 对纤维蛋白裂解产物(FDP)含量的影响　

纤维蛋白是血栓的主要成分, 也是构成血栓的其它细胞和血液成分的网套。大分子三体结构的纤维蛋白原被凝血酶水解, 释放纤维蛋白肽A 和肽B 后, 转变成纤维蛋白单体。释放前者是纤维蛋白自身集合的先决条件, 而后者释放关系到原纤维蛋白丝的形成FDP 是纤维蛋白被纤溶酶逐级降解的产物之一。因此, FDP 含量增加, 说明纤溶活性增强。向受试血浆中加入副凝剂———鱼精蛋白, 使可溶性纤维蛋白单体复合物释放出纤维蛋白单体, 形成肉眼可见的纤维蛋白絮状物。根据能否形成肉眼可见的纤维蛋白可推知受试血浆内的FDP 的相对含量。NK 可形成肉眼可见的纤维蛋白沉淀。说明NK 具有较强的纤维蛋白溶解活性, 可显著增加FDP 的含量, 表明NK 是通过直接水解纤维蛋白原或激活纤溶酶原来实现纤溶活性的。且相同剂量下, NK 的纤维蛋白溶解活性明显高于UK 。

3. 1. 4 　NK 的纤维蛋白溶解活性

纤溶系统在体内主要是将沉积在血管内外的纤维蛋白溶解, 起到修复、去除和防止血管内由于纤维蛋白沉积引起的阻塞作用。纤溶过程分为两个阶断:第一个阶断是纤溶酶原被纤溶酶原激活因子激活后, 转变为纤溶酶;第二个阶断为纤溶酶将纤维蛋白原裂解, 产生纤维蛋白原降解产物FDP 。此外, 纤溶酶还可水解凝血因子V 、Ⅶ 、Ⅷ等, 除以上促纤溶物质外, 血液中还存在对抗纤溶酶等, 正常情况下二者处于动态平衡。通过测定NK 对纤维蛋白溶解时间、纤维蛋白单体、纤维蛋白降解产物的影响, 证明NK 有强大的体外溶栓活性, 并通过激活纤溶系统或直接水解纤维蛋白原来实现其纤溶活性的。

3. 2 　纳豆激酶的体内血栓溶解实验

3. 2. 1 　NK 对颈动脉血栓形成的影响　

电刺激血栓形成法可以直接反映血管损伤后血栓的形成, 从而很好地表现抗血小板药与抗凝血药的作用。动脉受到刺激后, 可引起血管内膜损伤, 激活血小板和凝血系统, 同时损伤后的血管内皮细胞可使前列腺素(PGI2 )的合成和释放减少, 致使动脉血管内逐渐形成混合血栓。当动脉血管内血栓形成而堵塞血流时, 血管远端温度突降。据此可用温度传感器监测血管表面温度变化, 通过仪器自动报警, 记录从刺激开始到温度突降所需的时间, 即堵塞时间(Occlusion Time)又称血栓形成时间, 该时间越短, 表示越易形成血栓[ 12 , 13] ;反之, 时间越长, 表示越不易形成血栓。因此根据堵塞时间的长短可推断形成血栓的难易程度。试验组动物其血栓形成时间明显延长, NK 可使OT 时间显著延长, 表明NK 能显著降低形成血栓的可能。且相同剂量下,NK 的体内血栓形成抑制作用明显高于UK 。

3. 2. 2 　NK 对兔股动脉血栓的再通作用　

观察经血栓造模动物的动脉血流量变化是评价溶栓药物溶解血栓作用强度、作用快慢的重要指标。评价溶栓药物对动脉血栓的再通作用, 具有极为重要的临床意义。NK 能显著缩短股动脉的再通时间, 增加再通率和血流量, 并能显著降低股动脉血栓的长度、重量。说明NK 的再通效果显著、再通起效时间快, 并能显著地降低肺动脉内形成栓子的几率, 表明NK 能降低血栓形成的可能、迅速溶解血栓, 疗效显著、效果确实。具有强大而迅速的再通动脉血栓作用。且相同剂量下NK 的肺血栓溶解活性明显优于UK , 同时NK 起效时间明显快于UK 。

3. 2. 3 　NK 对实验性肺栓塞的溶栓效应　

对肺栓塞的溶栓效应是评价溶栓药药效的又一重要指标。对动物肺脏进行栓塞造模, 再观察给药后肺组织的病理变化、溶栓效果及血栓结构。从而可以很好的反应药物的溶栓作用。NK 可显著地降低肺内血栓的重量, 并改变血栓结构。表明NK 对肺血栓的形成有显著地抑制作用。且相同剂量下, NK 的肺血栓溶解活性明显高于UK 。

3. 2. 4 　NK 的体外溶栓作用　

血栓形成在体实验对于药效的评价具有重要价值。血液发生凝固或血液中某些成份析出、粘集形成固体物质, 即为血栓的形成过程。血栓形成必须具备以下条件:①心血管内膜损伤。②血流状态改变。③血液凝固性增高。针对血栓形成的条件, 通过对机械性损伤血管内皮细胞,减慢血流量、弥散性血管内凝血等三方面进行血栓造型研究了NK 对体内血栓的溶解活性。证明了NK不仅可能极显著地促进血栓溶解, 而且还能显著地抑制血栓形成。本研究结果显示:NK 具有强大地体内、体外溶栓作用。

参考文献

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