核酸酶研究往事IV—PCR的事,你知道和不知道的

PCR开创了生物技术的新起点，自PCR发明之后，科学家可以很容易的获得自然界存在的核酸片段，极大的促进了生物科学和应用的发展。许多故事经过多次演绎到了几乎失真的程度，那么PCR有哪些不为大家所熟悉呢。

（1）PCR开始是在水浴锅里进行的，三个温度很分明，分别是解链，退火，和延伸，由一个机械臂把试管从一个锅移到另一个锅。因为没有热盖，为了防止水分挥发，需要在溶液上加石蜡油。

水浴锅

（2）三个温度中延伸温度是37°C而不是现在通行的72°C，因为最初Mullis想到的是当时常用的聚合酶——Klenow。而Klenow是不耐热的，所以每次退火之后，在延伸之前，要向反应试管中加入新的Klenow酶，最初做PCR是一件非常耗时的工作，也是体力活。

Klenow酶

（3）Taq酶的发现是在1976年，是从黄石国家公园的温泉里耐热菌株里分离到的。在Taq酶得到应用之前，研究生物的人是不大受待见的，大家的总笑话，研究这些有什么意义啊？根本没什么用嘛。Taq酶被应用于PCR之后，被Science评为当年的年度。而第一个分离Taq酶的是华人学者钱嘉韵，她当时在辛辛那提大学读书，发表这篇文章后她没有再从事这方面的研究，而是转学去了爱荷华。钱嘉韵现在是台湾阳明大学的神经系教授。

钱嘉韵

（4）PCR技术发明后，这个组的其它成员因为这个项目，每个人获得了象征性的1美元的奖励，Mullis那时要离开Cetus公司，得到了10，000美元。而罗氏公司收购Cetus的时候，为PCR专利支付的转让费用是100，000，000美元。

Cetus公司

（5）荧光定量的发现是从实验error开始，做完PCR后，加入核酸染料再电泳是正确的流程，但是一个做实验的在配液的时候把染料液放进去了，然后观察到荧光随着循环数发生了变化，所以染料法的荧光定量技术就产生了。

（6）热启动PCR的方法，有化学法修饰Taq酶和抗体修饰Taq酶，但是修饰Taq酶并不是唯一热启动的方法，当然它是目前应用最广泛的方法。

基于抗体热启动技术的DNA聚合酶

（7）可以选择热启动引物，引物3’端羟基被化学基团封闭，温度较低的时候，反应无法延伸，在加热时候解除，进行特异性扩增。

（8）可选择热启动dNTPs, 如上，温度低时候，反应无法进行，加热后解除抑制，扩增反应开始。（有商业化的产品）

（9）可控制Mg(II)，有几种方法，一种是让Mg离子在低温下沉淀，升温后，Mg(II)溶解，反应开始进行。（Roche有专利描述这种方法）

（10）其它方法，把PCR反应的某种成分包裹在热敏材料里，在升温后释放到反应液里，反应开始。或者是用一种突变的酶，它无法催化延伸反应，而且温度敏感，温度低的时候，它阻止非特异性延伸，但是升温后它结合核酸的能力变弱，Taq酶催化反应开始(Stratagene申请过类似专利）

（11）以上（6）-（10）都是利用了PCR升温的特点，利用光敏材料，把某些组分封闭起来，然后在特定时刻点用特定波长的光来启动反应。

（12）除了三个温度循环的PCR，也有两个温度的循环的PCR，还有一个温度的PCR，就是等温PCR。通过一个细长的反应试管，没有热盖，整个反应液上下有一个温度差，解链，退火，延伸在不同的温度区域进行。

你还知道哪些不为多数人知道PCR的逸闻趣事呢？