右美托咪定对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺泡液体清除的影响

姜远旭　夏明珠　黄强　张雪萍　张中军

518020，暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院麻醉科，深圳市麻醉医学工程研究中心（姜远旭、黄强、张雪萍、张中军）；518020，深圳市罗湖医院集团湖贝社区健康服务中心（夏明珠）

深圳市科技研发基金（JCYJ20160422142317026）

ORIGINAL ARTICLES

【论著】

本次研究通过检测右美托咪定（Dex）对脂多糖（LPS） 诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠肺泡内液体清除率（AFC）及肺组织钠钾三磷酸腺苷酶（Na-K-ATPase）、肺泡上皮细胞钠离子通道（ENaC）表达的影响，进一步证实Dex减轻肺水肿的作用是否与促进肺泡内液体清除有关。

1.1　主要实验试剂

LPS，Dex，TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒，Trizol总RNA提取试剂，兔抗Na-K-ATPase、ENaC单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗及抗β-actin抗体。

1.2　动物分组和处理

SPF级雄性Wistar大鼠48只,体重180～220 g。随机分为3组：生理盐水对照组（NS组）、ALI模型组（LPS组）、Dex治疗组（LPS+Dex组），每组16只。NS组股静脉注射生理盐水5 ml/kg，即刻股静脉持续输注5 μg·kg-1·h-1的生理盐水；LPS组股静脉注射LPS 10 mg/kg，即刻股静脉持续输注5 μg·kg-1·h-1的生理盐水；LPS+Dex组股静脉注射LPS 10 mg/kg，即刻股静脉持续输注5 μg·kg-1·h-1的Dex。

1．3　实验方法

1.3.1　动物模型的建立

实验前禁食12 h,自由饮水。腹腔注射3%钠50 mg/kg ，大鼠麻醉后将其仰卧固定。乙醇消毒左大腿侧皮肤，剪开皮肤并暴露股静脉，置入24#套管针并固定，随即给予LPS 10 mg/kg (推注时间10 min左右)，推注完毕，给予0.2～0.5 ml生理盐水冲刷血管壁。

1.3.2　气管切开

注射LPS或生理盐水后，颈部皮肤消毒，正中切口，暴露气管并造口，插入自制气管导管。

1.3.3　动脉血气分析

注射LPS或生理盐水后6 h，用肝素注射器经颈动脉抽取颈动脉血0.5 ml进行血气分析，测血PaO2。

1.3.4　肺组织湿/干重比（W/D）

每组另选取8只大鼠，注射LPS或生理盐水后6 h，颈动脉放血处死大鼠后，立刻剖胸取出右肺上叶，滤纸沾干表面水分，置于一干燥洁净的小玻璃瓶中，精确称重后，置75 ℃恒温烤箱中，烘烤24 h 至恒重后测定肺组织干重，计算W/D以评估肺组织的水肿程度。

1.3.5　肺组织TNF-α、IL-1β的浓度

每组另选取8只大鼠，右颈动脉放血处死动物后，即刻剖胸，冰面上取出左肺上叶，采用ELISA 法测定肺组织TNF-α、IL-1β的浓度，严格按照说明书进行操作。

1.3.6　AFC的测量

每组另选取8只大鼠，颈动脉放血处死动物后，将气管、肺和心脏整体取出，按5 ml/kg 抽取Evans 蓝（0.15 g/L）标记的5％牛血清白蛋白灌注液，将灌注液经气管注入大鼠肺内，并经导管注入2 ml氧气以确保灌注液到达肺泡腔。持续给予100%氧气保持肺一定的张力，保鲜膜包被后放入37 ℃水浴箱孵育1 h，吸出肺泡内液体。用酶标仪读取Evans 蓝标记白蛋白的注入前后浓度。按公式AFC（％）=［（Cf-Ci）/Cf］×100％，Ci 为Evans 蓝标记白蛋白注入前浓度，Cf 为Evans 蓝标记白蛋白吸出后浓度，计算出AFC。

1.3.7　病理学检查

每组另取8只大鼠，颈动脉放血处死后，立即剖胸取右肺中叶用10%中性甲醛固定24 h后,给予脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片（厚度4 μm），H-E染色。光镜下观察肺组织病理学变化并进行病理学评分。

1.3.8　肺组织Na-K-ATPase、ENaC的免疫组织化学检测

取右肺中叶于10%中性甲醛溶液中固定，常规制作石蜡组织切片，按免疫组化试剂盒说明书操作，检测Na-K-ATPase、ENaC的表达。

1.3.9　Western blot 分析Na-K-ATPase、ENaC表达

按照裂解液说明书提取蛋白。将50 μg 粗蛋白经冰水浴中聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至醋酸纤维膜上。室温下用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液对膜封闭1 h；封闭完毕后用含有 Tween-20的PBS洗膜5次，每次间隔5 min,洗膜后加入Na-K-ATPase、ENaC抗体 ，4 ℃孵育过夜；洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体 ，室温下孵育3 h，洗膜5次，每次间隔5 min，最后加入化学发光增强剂，自显影。采用图像分析处理系统对蛋白条带扫描分析，根据各组蛋白光密度值与β-actin光密度值的比值表示Na-K-ATPase、ENaC相对表达量。

2.1　PaO2、W/D、TNF-α、IL-1β浓度变化

与NS组比较，LPS组PaO2降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与LPS组比较，LPS+Dex组PaO2升高，差异有统计学意义（P<0.01，表1）。与NS组比较，LPS组W/D、TNF-α、IL-1β增加（P<0.01）。与LPS组比较，LPS+Dex组W/D、TNF-α、IL-1β降低，差异有统计学意义（P<0.01，表1）。

2.2　AFC比较

与NS组比较，LPS组AFC降低（P<0.01）。与LPS组比较，LPS+Dex组AFC升高，差异有统计学意义（P<0.01，图1）。

2.3　肺组织病理学检查

NS组肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡间隔无水肿及炎细胞浸润等改变（图2A）。LPS组出现明显的肺损伤改变：肺泡壁水肿、肺间质增厚、血管充血及大量炎性细胞浸润，肺泡结构破坏（图2B）。LPS+Dex组肺泡结构尚可，肺间质和肺泡腔内渗出物及炎性细胞浸润较LPS组明显减少（图2C）。

2.4　肺组织免疫组织化学染色

NS组ENaC主要分布在肺泡上皮细胞中顶侧膜，呈强阳性表达水平，Na-K-ATPase主要分布在肺泡上皮细胞的基底侧膜，呈棕黄色强阳性表达。LPS组Na-K-ATPase、ENaC呈弱阳性表达。LPS+Dex组Na-K-ATPase、ENaC表达阳性（图3）。

2.5　肺组织Na-K-ATPase、ENaC蛋白表达

与NS组比较，LPS组Na-K-ATPase、ENaC蛋白表达降低（P<0.01），与LPS组比较，LPS+Dex组Na-K-ATPase、ENaC蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.01，图4、图5）。

我们的研究显示，给大鼠静脉注射LPS 6 h后肺组织炎性细胞因子表达增加，病理检查显示肺泡间隔明显增厚，肺泡结构破坏,中性粒细胞浸润增加，肺组织W/D明显升高，出现低氧血症，提示LPS成功诱导了ALI，且伴随有明显肺水肿。与LPS组比较，LPS+Dex组明显减轻肺组织炎性反应及肺水肿，PaO2增加，提示本实验中Dex能减轻LPS诱导的ALI相关肺水肿。

与LPS组比较，LPS+Dex组AFC明显升高，肺组织水肿减轻，PaO2明显升高，提示Dex减轻肺水肿的作用与促进肺泡内液体清除有关。

与NS组比较，LPS组肺组织 Na-K-ATPase表达降低，提示LPS诱导的ALI相关肺水肿存在液体清除障碍。与LPS组比较，LPS+Dex组Na-K-ATPase的表达增加，表明Dex增加AFC及减轻肺水肿的作用部分与增加Na-K-ATPase有关。

与NS组比较，LPS组肺组织ENaC表达降低。与LPS组比较，LPS+Dex组ENaC的表达增加，表明Dex减轻肺水肿的作用与增加ENaC的表达有关。

本研究中，Dex明显减少肺组织TNF-a、IL-1β的含量，提示Dex增加Na-K-ATPase和ENaC的表达可能与抑制TNF-a、IL-1β的释放及减轻肺组织炎

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