FFPE那些事儿(上篇)

经过福尔马林固定、石蜡包埋处理能够长期保存组织样本，但是后续DNA的难以提取，提取出的DNA质量差、总量低以及组织（常指肿瘤组织）占比低等特点一直饱受诟病^[1]。由于甲醛固定剂的处理、长时间的包埋等原因，FFPE样本的DNA质量容易受到多种因素的干扰和影响。

表 1.  影响FFPE样本中DNA质量的因素

包埋肿瘤组织的FFPE样本，因其特殊处理工艺，对后续研究结果的分析带来了一些不确定因素，主要可以分为假阴性和假阳性两大类。

表 2.  FFPE样本中常见错误的产生因素

其中假阳性的出现对于基因检测，尤其是低频突变的检测，会造成很大的干扰。主要是在组织采集、福尔马林固定和保存过程可能会人为地引入突变，如胞嘧啶经脱氨基转变成尿嘧啶。由于缺少尿嘧啶DNA糖基化酶（uracil-DNA glycosylase, UDG）的修复，形成“C>T”的人为突变。5-甲基胞嘧啶脱氨基后形成胸腺嘧啶，随即与腺嘌呤结合，而不是鸟嘌呤，形成“G>A”的人为突变。C>T和G>A的突变是人为引入单碱基突变的主要部分^[1]。早期的一篇关于FFPE样本和冷冻样本突变检测一致性分析的文章中指出，每500 - 2050 bp可能会出现一个人为突变；其中C>T和G>A的人为突变占据了假阳性突变的96%以上^[4]。

图 1.胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶、腺嘌呤的结构示意图^[5]

为了规避FFPE样本的假阴性和假阳性结果，我们首先要从其源头出发，立足根本，在提取步骤提取尽可能多的高质量DNA。如在进行组织取样时，尽可能包埋含量多的肿瘤组织；组织的固定时间不宜太长，3-6h为宜^[1]；接着就是慎重的选择FFPE样本提取试剂盒。

现在市面上商业化的提取试剂盒很多，主要原理都是利用二甲苯或矿物油裂解，脱离出组织切片中的DNA，克服福尔马林交联造成的抑制效应，随后再利用离心柱或者磁珠纯化。这些操作都是针对其固定过程进行反向处理和修复的（图 2）。

图 2.FFPE样本提取的一般流程

IDT公司对4款商业化FFPE样本提取试剂盒进行了直观的比较 ，结果显示使用不同提取试剂盒（皆不含特殊修复作用）提取出的gDNA总量和质量差别并不明显（图 3）。

图 3. 4款商业化提取试剂盒，对不同含量、不同类型的FFPE样本的完整性 (DNA Integrity Number, DIN)的比较研究

针对FFPE样本的特殊难点，一些公司陆续推出了对FFPE样本进行修复的试剂盒，比如在提取过程中添加了修复人为引入突变的酶（类UDG）^[5]；或者在提取完成之后对DNA进行修复^[6]。其他实验表明，对于福尔马林固定保存时间相对不长的FFPE样本，类UDG预处理可以减少人为突变从而有效提高整体NGS质量和测序结果^[7]。还有一些研究表明，在提取中适当提高蛋白酶K消解孵化的温度能够有效的增加DNA的提取量^[8，9]。

FFPE样本是肿瘤研究与应用中最重要和最常见的分析材料。考虑到其固有缺点，任何基于FFPE样本的分析方法都有必要从样本提取的源头着手以提高后续分析结果的准确性。这些方法包括适当提高进入提取试剂盒的固定组织量、增加提取时消解孵化步骤的温度、使用带修复作用的试剂盒或者提取后进行DNA的修复等操作。

利用NGS分析方法考察肿瘤样本中的突变、拷贝数变化与结构变异等日渐常规化。FFPE样本DNA的提取量和质量与NGS文库构建以及下游数据分析密切相关，我们将在后续文章中进一步讨论。

[1]Mj C, W L,L D, X L. Tissue Requirements and DNA Quality Control for Clinical TargetedNext-Generation Sequencing of Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples: AMini-Review of Practical Issues. Journal of Molecular and Genetic Medicine.2017;11(2).

[2]Klopfleisch R, Weiss A T, Gruber A D. Excavation of a buriedtreasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffinembedded tissues. Histology & Histopathology, 2011;26(6):797–810.

[3]http://sg.idtdna.com/pages/education/videos/next-generation-sequencing/videos/default-source/webinar-videos/next-generation-sequencing/ngs-giorda-webinar-102616.

[4]Williams C, Pontén F,Moberg C, et al. A High Frequency of Sequence Alterations Is Due to FormalinFixation of Archival Specimens. The American Journal of Pathology.1999;155: 1467-1471.

[5]https://www.qiagen.com/cn/shop/sequencing/generead-dna-ffpe-kit/#productdetails

[6]https://www.neb.com/products/m6630-nebnext-ffpe-dna-repair-mix#Product%20Information

[7]Kim S, Park C, Ji Y, et al. Deamination Effects inFormalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Samples in the Era of PrecisionMedicine. Journal of Molecular Diagnostics Jmd.2017; 19(1):137-146.

[8]Xie J, Lu X, Wu X, et al. Capture-basednext-generation sequencing reveals multiple actionable mutations in cancerpatients failed in traditional testing. Mol Genet Genomic Med.2016;4(3):262-272.

[9]https://www.qiagen.com/cn/shop/sample-technologies/dna/genomic-dna/qiaamp-dna-ffpe-tissue-kit/#productdetails

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