牛樟芝滴丸护肝功效实验研究
刘典谟 段俊国
成都中医药大学，四川 成都610037
【文章编号】1007-8517 (2012)08～0055-02
牛樟芝滴丸以牛樟段木子实体为原料，经酒水超临界萃取技术浓缩，保留了牛樟芝完整的保健疗效精华，制作成滴丸剂型，可以口含舌下吸收，经粘膜迅速进入血液发挥疗效，避免有效成分在消化过程中遭到破坏。经药代动力学研究证实，于身体的吸收率为牛樟芝胶囊或粉剂的6.6倍以上，因此牛樟芝滴丸能提高身体利用率，具有极高经济效益。
目的：
研究台湾特产牛樟芝滴丸的护肝功效。
方法：
采用以自动生化分析仪检测肝功能GOT、GPT生化指数；抗氧化功能相关产物麸胱甘、麸胱甘过氧化酶、超氧化物歧化酶及蛋白质浓度活性分析，以评估肝功能效价。
结果：
血中肝功能生化指数检测结果显示，大白鼠腹腔注射APAP会升高血中GOT及GPT指数，肝脏细胞的GSH浓度也会减少，SOD及GPx的酵素活性也都下降。
牛樟芝滴丸可降低GOT及GPT指数，升高GSH浓度；牛樟芝滴丸可回复SOD及GPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现，对于保护肝脏功能确有帮助。
牛樟芝(Antrodia camphorata)为仅生长在台湾特有的牛樟树上，为台湾珍贵特有的真菌，经常被应用于养生保健上。早期台湾原住民用来治疗因饮酒过度所造成的肝脏病变，被原住民视为珍宝。
樟芝子实体和一般的食药用蕈菇类一样具有复杂的成分，包括多醣体、三帖类(triterpenoids)、超氧歧化酵素(superoxidedismutase)。这些成分的生理活性功能包括：抗肿瘤、提升免疫能力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血醣、降胆固醇、抗细菌及保护肝脏。
目前对牛樟芝的研究方向以樟芝子实体甲醇萃取物或水萃取物之抗氧化、抗癌、及保护肝脏为主。前期研究采用滴丸制剂改善牛樟芝水不溶性成分吸收研究，本研究将继续探讨其新剂型的护肝功效。
实验方法
1．1 实验设计
将每组12只以上雄性BALB／c小鼠(20—25克)分为6组，分别为：
A．正常对照组：生理食盐水(I．P．) +d．d．H O(P．O．)；
B．负对照组(肝损伤组)：400mg APAP／kg bw (I． )+ d．d．I-I20 (P．0．)；
C．正对照组(N—acetylcysteine(NAC)治疗对照组)：400mg APAP／kg bw (I．P．) +600mg NAC／kg bw (P．O．)；
D．牛樟芝滴丸一倍剂量(1x)实验组：400mg APAP／kg bw(I．P．) +牛樟芝滴丸(20颗／kg bw)(P．O．)；
E．牛樟芝滴丸3倍剂量(3X)实验组：400 mg APAP／kg bw(I．P．)+牛樟芝滴丸(60颗／kg bw)(P．O．)；
F．牛樟芝滴丸5倍剂量(5X)实验组：400 mg APAP／kg bw(I．P)+牛樟芝滴丸(100颗／kg bw) (P．O．)。
1．2 步骤
A组腹腔注射生理食盐水(0．6ml／30g bw for mice)，B— F组腹腔注射400mg APAP／kg bw (0．6ml／30g bw formice)，每周两次(星期一及四)于样品灌喂前一小时进行肝炎诱导，减少药物及样品互相影响；并在A、B组每日灌胃d．d．water，在C组灌喂NAC(600 mS／kg bw for mice)，在D—F组则分别灌以试验样品，共为期八周。
所有实验动物每周投予试验样品(d．d．H 0或NAC)后4小时，以尾部采血方式检测肝脏的生化功能：GOT(AST)、GPT(ALT)。
最后于第八周结束时全部牺牲，并剖腹取肝脏标本，秤重后将最大右叶肝割取一半固定于l0％ 的中性福尔马林(formaline)液中，石蜡包封切片后分别作苏木紫一伊红染色(haematoxylin—eosin stain，HE stain)来进行病理学观察外，并做胶原蛋白的特殊染色(Masson’strichrome stain)，以便评估肝纤维化程度。
另外将其余肝脏分别进行检测抗氧化成分glutathione(GSH)、glutathione per．oxidase(GSH Px)、glutathione reductase(GSH Rd)、glutathi—one Stransferase(GST)、superoxide dismutase(SOD)与catalase等酵素活性。
实验数据统计分析采用SAS计算机统计软件包(SASinstitute，Cary，NC)进行变异数分析(analysis of variance，ANOVA)，并以Duncan@test来测试不同处理间显著差异效果(P<0．05)。
1．3 肝功能生化指数的检测
所有小鼠血液样品在室温下放置一小时以使其凝结。再以冷冻离心机于4~C下每分钟12，000 rpm离心5分钟，来分离血清。再以自动生化分析仪检测肝功能生化指数，如GOT、GPT等。
1．4 抗氧化功能相关产物及酵素活性之分析
(1)麸胱甘(Glutathione，GSH)浓度之分析Glutathione浓度的分析系采用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione assay kit)测定之，其检测方法简述如下。
取肝组织，以均质液(50 mmol／1 MES，1 mmolfl EDTA，1 mmol／1 DTr，pH 6—7)均质之，在10，000 g，4~C下离心15分钟。取上清液以等体积的方式加入1 mol／1之metaphosphoric acid溶液混合之，于室温下反应5分钟后离心(3，000 g，2分钟)，取上清液加入4 mol／1之triethanolamine(20：1，v／v)混合。取此混合液501xl加入150之assay Cocktail(MES，reconstituted Cofactor Mixture，recon．stituted Enzyme Mixture，reconstituted DNTB)，反应开始后，以plate reader读取每5分钟405 nm波长的吸光值至反应进行至30分时为止，计算GSH之浓度。
(2)麸胱甘过氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)活性之分析GPx酵素的活性系使用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione peroxidase assay kit)测定之，其检测方法简述如下。
取肝脏细胞，以均质液(50 mmol／1 Tris—HC1，5 retool／1 EDTA，1 mmol／l D'YF，pH 7．5)均质之，在10，000 g，4℃下离心15分钟。取上清液201~1加入1001~1的assay buffer(50 mmolfl Tris—HC1，5 mmol／1 EDTA，pH7．6)、501xl的CO—substrate液(1yophilized NADPH，glutathione，glutathione reductase)混合后，加入2O 含Gumenehydroperoxide的溶液开始反应。每分钟以plate reader分析340 nm波长的吸光值并纪录之，最后分析GPx酵素的活性(specific activity)。
(3)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性之测定SOD酵素的活性系使用Dojindo Molecular Technologies公司生产的分析试剂组(SOD assay kit—WST)测定之，其检测方法简述如下。
取肝组织加入适量缓冲液(0．32 mol／1Sucrose、l mmolfl EDTA、10 nmolfl Tris—HC1，pH 7．4)均质之。以1，400g离心5分钟，取上清液，再以4，500 g离心1O分钟，下层之沈淀物加入缓冲液测Cu／Zn—SOD(cytosolic SOD)，上清液再以11，000 g离心60分钟，取沈淀物加入缓冲液分析Mn—SOD (mitochondrial SOD)。
每20微升的检体，加入200 的Reagent Solution及20 的EnzymeWorking Solution，于37℃反应20分钟，再读取450 am波长的吸光值并计算SOD的活性。肝组织SOD活性，以每单位蛋白质所含SOD单位量表示(U／mg protein)。
(4)蛋白质浓度之测定
实验参照Lowry之方法进行(Lowry et a1．，1951)。取适量蛋白质样品，并以1 N NaOH来调整使其最终体积为100 ml，加入200 ml去离子水及100 ml反应混合液(25％Na2CO3 ：2％ Na—K—tartarate ：1％ CuSO4 = 8 ：1：1，v／v／v)，然后在室温下静置10分钟，加入1 ml Folin reagent(Folin：H20 =1：19．5)后于37℃水浴2O分钟，并在室温下冷却，最后在分光光度计以660 nm下测其吸光值(25℃)。然后将标准曲线做线性回归，得一方程式，将所得样品之吸光值代入此一元一次方程式，换算后即可得知样品之蛋白质含量。
1．5 实验数据统计分析
所有的数据均以平均值4-标准差来表示(mean 4-SD)。不同药物处理的组别以变异数分析(ANOVA)计算，并以Duncan’s post—hoc test评估其统计上之差异；P值小于0．05者表示具有显著的差异。
结果与结论
2．1 牛樟芝滴丸对肝功能相关酵素活性的影响
从西医的角度，当肝脏受到疾病或及他因素导致肝细胞的损伤时，可以由血中的肝功能生化指数上升来进行初步的检测。一般而言，指的就是血液中GPT及GOT两种酵素的活性上升。 因此，对于药物或是健康食品是否具有疗效或是保护肝功能的作用，可以由该药物或健康食物是否能回复其肝功能着手(Wonget a1．，2000；Hase et a1．，1996)。
负对照组的小鼠经腹腔注射乙酰胺基苯酚(APAP)后，其血清GOT、GPT的指数，在处理后的第一周，显著的较正常对照组为高，显示APAP在一周时己对小鼠的肝脏产生损坏，同时，GOT及Girl"的指数到实验结束前仍维持显著上升的现象。因此，本项实验动物模式确实为慢性肝损伤动物，可供药物或健康食品进行护肝功效的评估。
正对照组除注射APAP之外，同时也以口服的方式给予小鼠N一乙酰半胱胺酸(N—acetylcysteine，NAC)治疗。与正常对照组相较，处理一到八周的GOT及GPT的指数均显著的较高，然而与负对照组相较，则明显的降低。
治疗组的GOT及GPT指数，在实验过程中虽显著的较正常对照组为高，然而经口服给予牛樟芝滴丸的治疗后，与负对照组相较，其GOT及GPT指数可随着牛樟芝滴丸剂量的增加，呈现剂量相关性的降低。
